新加坡通过“自下而上”的分子工程研发水凝胶分子传感器

分子传感器对周围环境中的目标分子作出反应，以检测甚至量化其浓度。传统上，这些技术由小的有机分子或金属络合物组成，对于生物医学和环境监测，确保人类健康，安全和总体健康至关重要。在过去的二十年中，分析物响应型水凝胶已成为一项新兴技术，在世界范围内受到了广泛的研究关注。已经开发出了能够检测多种分析物的水凝胶，包括无机离子，碳水化合物，硫醇，气体，生物分子(核酸和蛋白质)，甚至是微生物，例如细菌和病毒。由于在分子水平和生物相容性方面具有自下而上设计的附加优势，使用水凝胶传感器进行分子检测通常很容易执行，并且水凝胶可以与电子设备集成在一起以提高检测灵敏度，或者与生物医学设备集成用于体外和体内学习。新加坡材料研究与工程学院Jason Y. C. Lim 和Xian Jun Loh研究人员先前在《ACS Materials Letters》上综述了Bottom-Up Engineering of Responsive Hydrogel Materials for Molecular Detection and Biosensing一文。讨论了为工程水凝胶分子传感器开发的一系列创新策略，重点是“自下而上”的分子工程以实现分析物的选择性和灵敏度。

【凝胶特性】

水凝胶可表现出对外部刺激的响应性，例如光，温度，pH，机械力(例如，超声)，磁场和分子分析物，其可用于诸如药物或治疗分子的按需释放之类的功能。

水凝胶可以包含共价接枝到其结构上的响应分子单元，用作交联点(例如离子水凝胶的金属阳离子)，或简单地物理混合到凝胶材料中而没有任何共价键。

水凝胶高度多孔的分子网使大的暴露表面积与周围的分析物溶液接触，从而使它们之间保持持续快速的对话。

【图文解析】

在存在分析物的情况下，这些基团会引起光学变化，例如可见颜色或荧光强度(示意图1A-C)。或者，水凝胶材料本身可以通过物理体积变化(示意图1D，1E)，凝胶化(示意图1F)或水凝胶塌陷(示意图1G)对分析物做出响应。当水凝胶的反应单元经过化学修饰时，例如与氧化还原活性分子(例如，硫醇或活性氧物种)反应，超分子与分析物相互作用(例如，与DNA适体的氢键键合)或仅经历电离会改变聚合物上的净电荷。通过将分子水平的识别事件转化为宏观变化，这种水凝胶材料可以放大检测响应，有时可以以非常低的浓度检测分析物。另外，这些变化中的一些(例如，凝胶膨胀)可以与敏感的电子设备耦合，以进一步增强分析物检测的灵敏度。例如，可以使用光学传感器检测凝胶体积的变化，该光学传感器对光透射，折射或衍射的变化做出响应;压电传感器和微悬臂梁，可检测膨胀后的压力或质量变化;或可以检测凝胶电场变化的场效应晶体管(FET)。水凝胶传感器已经开发出来，可以检测几乎所有可能的分析物类别，包括离子，中性分子，气体，化学战剂，甚至包括微生物，例如细菌和病毒。

示意图1.分子响应水凝胶的分析物传感机理

水凝胶分子传感器和生物传感器

1.阳离子

由于某些物质(例如Ni2+，Cu2+，Hg2+，Pb2+和Cd2+)的毒性以及其他物质对生物学(Na+，K+，Mg2+，Zn2+和Fe3+)的重要性，因此检测和定量水溶液中阳离子的浓度非常重要。

主族阳离子

2011年，Ballester及其同事发现，在四甲基铵(TMA+)阳离子存在下，杯[4]吡咯1(图1)的碱性水溶液可以在Na+存在下选择性地形成稳定的水凝胶。

图1.Ballester的杯[4]吡咯，用于由Na+触发的选择性溶胶-凝胶转变

Xie团队随后开发了一种更通用的阳离子检测方法，即利用染料置换分析法检测Na+，Ca2+和Pb2+。在他们的方法中，将含有合适离子基团的离子选择性微滴(可选择性结合目标阳离子)，亲脂性离子交换盐，阳离子染料和增塑剂包埋在琼脂糖水凝胶基质中(图2A)。如图2B所示，当染料通过阳离子置换从水凝胶相释放时，它优先位于疏水性悬浮的纳米球中。这使水相中的染料浓度保持较低，以进一步驱使染料释放。水凝胶层对于保持第一相(离子选择性微滴)与纳米球物理分离至关重要。(参考：Chem. Commun. 2019, 55, 1774– 1777,)

图2.(A)两相染料置换分析法，用于选择性感测Pb2+，Ca2+和Na+。(B)用于K+检测的改进的三相染料置换水凝胶测定法，具有更高的灵敏度。

过渡金属阳离子

汞是一种剧毒的重金属，会导致严重的环境和健康问题。 饮用水的限值为10 nM Hg2+(美国环境保护署)。

在2010年，Liu等人报道了一种DNA功能化的聚丙烯酰胺水凝胶，可以检测和去除环境水中的Hg2+。作者在设计中利用了Hg2+对胸腺嘧啶(T)碱基和聚(丙烯酰胺)的亲和力，将富含T的DNA丙烯酸与丙烯酰胺和双(丙烯酰胺)(交联剂)共聚形成能够吸收Hg2+的水凝胶。在没有Hg2+的情况下，DNA链采用随机的卷曲结构，而当存在Hg2+时，T-Hg2+-T配位诱导了发夹结构。加入荧光染料DNA SYBR Green I后，前者在UV激发下会发出微弱的黄色荧光，而后者会在1小时的响应时间内产生强烈的绿色荧光(图3A)，即使用肉眼也可以检测到。(参考：J. Am. Chem. Soc.2010, 132, 12668– 12673)

图3.(A)Liu的富含T的DNA功能化的荧光水凝胶，用于检测Hg2+。(B)Gu的基于IFP的Hg2+感测水凝胶。(C)Wang的光子晶体水凝胶传感器在制造和Hg2+检测期间的尺寸变化。

2.阴离子

检测和定量水溶液中阴离子的浓度非常重要，因为许多阴离子在低浓度下可能有用，但在较高浓度下(例如F–，I–和NO3–)有毒。

卤化物

已知卤化物会与银(I)反应形成不溶性盐，AgX的稳定常数从F

尽管可以通过Ag(I)金属金属的崩解检测到较大的卤化物，但氟化物却不能。Zhou和Li而是利用F-对硅氧烷的反应性来开发氟化物引发的荧光水凝胶。该对将MAA封端的CdTe量子点与烷基铵官能化的硅氧烷在水中混合，以形成荧光溶液(图4)。(参考：ACS Appl. Mater. Interfaces 2012, 4, 721– 724)

图4.(A)具有F基团检测结果的具有硅氧烷基团的Li's CdTe量子点交联。(B)杨氏水凝胶封装的水不溶性荧光探针2与F–的反应。(C)用于氟化物感测的Ghosh和Pati基于吡ido醛的胶凝剂4的结构。

含氧阴离子

除卤化物外，还需要检测其他阴离子。 张等人研发了一种含氧阴离子触发的水凝胶。质子化的三聚氰胺可以在室温下pH 2至5之间与含氧阴离子NO3-，SO42-，PO43-和5'-三磷酸腺苷(ATP)形成凝胶。通过调节至7以上的pH值或加热至50°C以上。选择性的基本原理是含氧阴离子在质子化的三聚氰胺分子之间形成氢键“桥”的能力，因为它们具有≥3个氧原子(图5A)。这些凝胶可在离子强度(NaCl，0-1 M)变化的溶液中形成，因此可用于检测可能引起富营养化的过量环境磷酸盐和硝酸盐。(参考：Chem. Commun. 2010, 46, 6786– 6788)

图5.(A)Zhang提出的三聚氰胺与含氧阴离子凝胶化的结构。(B)(i)Hamachi荧光水凝胶中用于凝胶识别的胶凝剂5和化学传感器6-8的结构。(ii)在结合不同的磷酸酯衍生物后，化学传感器6在水凝胶中的重新分布。(iii)FRET系统7和8在结合不同的磷酸酯衍生物时的响应示意图。(C)Liu的荧光水凝胶中用于ATP感应的胶凝剂9的结构。(D)Tu的锌络合物10的结构，这些锌络合物形成ATP触发的荧光水凝胶。

其他

Lin和他的同事分别开发了一种多刺激响应水凝胶，用于体外荧光检测氰化物，汞和半胱氨酸(图6A)。作者合成了萘酰亚胺功能化的支柱[5]芳烃(PNA)，它可以与双吡啶盐(GBP)自组装以在DMSO/H2O中形成超分子水凝胶(PNAGBP，80 mM，1：1)。该凝胶具有强黄色荧光(在λex= 365 nm处，λem= 530 nm)，这是由于柱状芳烃腔中包含吡啶鎓基团引起的AIE所致。(参考：Macromolecules 2017, 50, 7863– 7871)

图6.(A)Lin的PNAGBP·I2水凝胶的自组装，用于CN-，Hg2+和Cys的荧光检测。(B)Wang的发光纳米纤维素水凝胶的自组装。

3.与生物有关的分子和生物分子

葡萄糖

糖尿病是一种主要的代谢疾病，2014年影响全球近18岁以上人口的8.5%。毫不奇怪，庞大的葡萄糖传感器市场是由糖尿病患者不断监测其血糖水平的需求所驱动的，其中85% 包括葡萄糖传感器的生物传感器市场。已经开发了各种各样的葡萄糖反应性水凝胶以检测和定量分析物，或者用作响应于葡萄糖水平原位控制释放治疗剂(例如胰岛素)的智能平台。

传统地，测定中的葡萄糖选择性是由天然存在的蛋白质提供的，例如结合葡萄糖的伴刀豆球蛋白A(ConA)或葡萄糖氧化酶(GoX)。毫不奇怪，掺入这些蛋白质的葡萄糖反应性水凝胶也是众所周知的，它利用水凝胶的生物相容性来维持这些蛋白质的天然活性。Miyata等人设计的一种葡萄糖反应性水凝胶。包含共价接枝到聚甲基丙烯酸葡萄糖基氧基乙基酯(polyGEMA)聚合物上的ConA，该聚合物包含多个侧链葡萄糖基单元(图7A)。由于每个ConA单元和四个葡萄糖基单元之间的结合，凝胶网络内发生了广泛的交联。在1 wt%葡萄糖溶液的存在下，额外的葡萄糖与ConA单元结合，从polyGEMA主链上释放悬垂的葡糖基单元，从而降低了交联的程度。这导致水凝胶膨胀。像ConA一样，GoX也可以共价接枝到聚合物水凝胶上。在Lee的含有若丹明B侧链和荧光素单元的聚(丙烯酰胺/丙烯酸酯)水凝胶中(图7Bi)，随着凝胶颜色和荧光的变化发生了葡萄糖反应。在添加葡萄糖之前，水凝胶在中性pH值下显示弱的绿色(518 nm)和红色(598 nm)荧光。当添加葡萄糖时，接枝的GoX将葡萄糖氧化为d-葡萄糖酸1,5-内酯，然后将其水解为葡萄糖酸，从而降低了凝胶介质的pH。由于荧光素内酯环的闭环，这降低了绿色荧光的强度，而若丹明B的内酰胺单元的开环发生，则增强了598 nm处的红色荧光，从而导致凝胶的整体荧光从绿色变为橙色。荧光的比例变化(I598 / I518)(图7B(ii))可用于定量葡萄糖浓度，LOD为0.87 mM。由于GoX对葡萄糖的选择性，未观察到其他单糖(例如半乳糖，甘露糖和果糖)以及NaCl，KCl和CaCl2电解质的响应。在这两个例子中，蛋白质的共价接枝阻止了蛋白质从凝胶中浸出，从而确保了对葡萄糖的可逆反应。(参考：J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 2004, 15, 1085– 1098,)(Polym. Chem. 2016, 7, 6655– 6661,)

图7.(A)在葡萄糖存在下宫田的ConA接枝水凝胶溶胀。通过(ii)荧光的比例变化(I598/I518)来检测和量化葡萄糖浓度。

尽管ConA和GoX具有出色的葡萄糖选择性，但是蛋白质变性经常会限制它们在传感器中的长期使用。为了克服这种缺陷，近年来，诸如苯硼酸(PBA)之类的全合成受体变得非常流行。硼酸可以与含有顺式二醇基团的单糖结合形成硼酸酯，如图8所示，该硼酸酯在水中稳定且可逆。

图8.(A)果糖和葡萄糖的6-元吡喃糖和5-元呋喃糖形式之间的平衡。(B)葡萄糖与含苯基硼酸的水凝胶的结合。(C)松本的水凝胶导管装置，用于皮下葡萄糖触发的胰岛素释放。

过氧化氢(H2O2)

作为生物氧代谢中自然产生的活性氧(ROS)，H2O2是传感应用的重要目标。由于其具有细胞毒性和氧化生物分子(例如DNA，蛋白质)的潜力，越来越多的证据表明H2O2可能是全身氧化应激的重要生物标志物。

可以通过触发凝胶塌陷来检测H2O2。Hamachi和他的同事设计了基于肽的LMWG，该肽含有硼酸芳基甲氧基羰基(BAmoc)，该基团与H2O2发生氧化消除反应(图9A)，以裂解氨基甲酸酯键并引起水凝胶塌陷(Nat. Chem. 2014, 6, 511,)。BAmoc基序也仅具有选择性到H2O2，其他ROS(例如OCl–和O2–)对引起凝胶到溶胶过渡无效。然而，该系统的缺点是需要高浓度的H2O2，相对于BAmoc需要0.5摩尔当量的H2O2。作者通过将信号放大系统整合到这种响应性水凝胶中来克服了这一限制。如图9B所示，每个放大器分子在H2O2存在下进行自消灭，释放出两个肌氨酸分子，这些肌氨酸分子又被肌氨酸氧化酶(SOx)氧化，生成另外两个H2O2分子。当将此H2O2扩增系统并入上述LMWG水凝胶网络中时，H2O2引起的凝胶塌陷的阈值降低了多达5倍。(参考：Nat. Chem. 2014, 6, 511)

图9.(A)H2O2氧化消除含BAmoc的LMWG，导致水凝胶塌陷。(B)使用信号放大系统增强H2O2灵敏度。

最近，Chai及其同事开发了一种创新的导电聚合物水凝胶，可使用电化学发光(ECL)检测从活细胞释放的H2O2。(参考：Anal. Chem. 2018, 90, 8462– 8469)

图10.使用导电PANI-PA水凝胶基质对活细胞释放的H2O2进行电致发光检测和定量。使用的ECL发光体是N-(氨基丁基)-N-(乙基异鲁米诺)(ABEI)。

硫醇

天然存在的硫醇(RSH)在生物学中起着重要的抗氧化作用。谷胱甘肽(GSH)是一种含有半胱氨酸残基的三肽，是动物体内发现的最丰富的生物硫醇，对于维持最佳的生化氧化还原过程至关重要。GSH的抗氧化特性来自其在清除氧气代谢产生的ROS时可逆氧化为GSSG二聚体的能力。因此，GSH与氧化的GSSG的比值是细胞氧化应激和氧化还原环境的指标。对于水凝胶传感器，生物硫醇检测方法是利用其独特的氧化还原特性，亲核性和金属配位能力而变化的主题(图11)。(参考：J. Clin. Med. 2017, 6, 50)

图11.利用(A)的氧化还原特性进行硫醇感测的不同策略，导致(i)(107)和(ii)中的LMW水凝胶塌陷，并导致(iii)中的交联水凝胶发生凝胶溶胀。(B)引发反迈克尔加成反应的趋势，导致凝胶溶解。(C)破坏金属-水凝胶中金属-配体交联的金属配位能力

酒精(乙醇)

监测生物发酵中乙醇的浓度是啤酒工业中最重要的过程之一，因为浓度超过10 vol%会导致酵母活性降低和产量降低。

用于乙醇感测的聚合物水凝胶材料依赖于其存在引起的水凝胶体积变化。例如，Erfkamp等在压电传感器装置中使用化学交联的聚(丙烯酰胺)-双(丙烯酰胺)水凝胶来检测乙醇。如图12所示，乙醇的存在会使水凝胶收缩，从而改变弯曲板上的溶胀压力，从而导致与乙醇浓度成比例的测量信号中的压阻变化。(参考：J. Sens. Sens. Syst. 2018, 7, 219– 226)

图12.Erfkamp用于乙醇的水凝胶压电传感器的设计。

其他与生物有关的分析物：毒素，药物和代谢物

Yang和Zhu的曲霉毒素A(OTA)DNA水凝胶传感器利用其适体使包含DNA链的聚(丙烯酰胺)交联形成水凝胶，并预先装载了13 nm AuNP。(图13).(参考：ACS Appl. Mater. Interfaces 2015, 7, 6982– 6990)

图13.(A)基于DNA适体的凝胶塌陷，用于检测O曲霉毒素A(OTA)。(B)体积条形图芯片，可轻松直观地量化OTA。

DNA适体水凝胶还可以方便地进行药物检测。例如，可卡因对水凝胶的破坏作用可以释放出预装的淀粉酶，该酶分解直链淀粉I2络合物，使溶液从深蓝色变成无色。碳纳米材料的结合，例如氧化石墨烯(GO)和碳纳米点 进入水凝胶也可用于荧光检测药物，如抗生素。GO的较大π表面以及其上附加的羧酸和羟基使富氮杂芳族分子(如腺苷)能够通过氢键和π堆积相互作用与之相互作用，从而形成水凝胶(图14)。

图14.抗生素感测策略。(A)GO-腺苷水凝胶，对土霉素具有“开启”荧光反应。(B)用于敏感四环素检测的分子印迹IOH。

4.气体

气态生物信号分子：一氧化碳和一氧化氮

总而言之，H2S，一氧化碳(CO)和一氧化氮(NO)是在人体中自然产生的仅有的三种已知的气态信号分子，它们负责调节大量的生物过程。

Yan的研究小组在2020年报告了一种高分子自修复水凝胶，其通过palladacycles交联形成动态大分子网络。含有30 wt%聚合物的水凝胶对CO的反应是发生不可逆的凝胶塌陷，这是由于Palladacycles经历了CO插入-消除反应而形成羧酸的结果(图16)。(参考：Polym. Chem. 2020, 11, 779– 783)。

图16.使用Yan的palladacycle交联的聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)聚((对二甲胺)甲基丙烯酸苄酯)水凝胶和(B)NO可以检测(A)CO的水凝胶的作用机理 i)聚丙烯酰胺基凝胶的溶胀，以及(ii)LMW水凝胶的凝胶塌陷。

二氧化碳(CO2)

由生物呼吸和碳氢化合物的氧化/燃烧产生的二氧化碳是一种重要的温室气体，需要定期监测其水平以评估室内空气质量，肺功能和许多工业过程。水凝胶传感器中的CO2检测通常利用溶解于水中时形成碳酸的能力，从而降低水凝胶溶液的pH值和使碱性官能团质子化，从而触发凝胶化或水凝胶溶胀。

CO2触发的胶凝是检测它的常用策略。Zhao报告了三嵌段PMAA-b-PEO-b-PMAA和PDMAEMA-b-PEO-b-PDMAEMA共聚物的水溶液，它们的不同pKa值在存在CO2的情况下导致不同程度的质子化(图17)。(参考：Macromol. Chem. Phys. 2017, 218, 1700146)

图17.用于水凝胶CO2传感的不同策略：(A)PDMAEMA在PMMA单元上的选择性质子化触发凝胶化;(B)2-氨基苯并咪唑的质子平衡，改变其与αCD的结合亲和力;(C)通过质子化触发蠕虫状胶束形成 溶解的二氧化碳使TMPDA分解。

氧气(O2)

铂(II)-卟啉配合物由于具有较高的光稳定性和较长的三重态寿命，因此可以用作荧光O2传感器，从而有效地将能量转移至O2，从而降低了其发射强度。通过将甲基丙烯酸酯基团连接到Pt-卟啉络合物上(图18A)，可以将该络合物与诸如甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)和丙烯酰胺之类的单体共聚，从而在石英玻璃基板上形成化学交联的水凝胶薄膜。当暴露于溶解有O2的饱和水溶液中时，观察到快速荧光猝灭(图18B)，仅需70 s即可获得稳定的荧光读数。(参考：Chem. Rev. 2008, 108, 400– 422)

图18.(A)掺入水凝胶膜中以进行O 2感测的活性Pt(II)-卟啉荧光团的结构。(B)随着O2浓度的增加，膜的荧光猝灭。(C)水凝胶膜的应用以监测不同氨苄青霉素(AMP)抗生素浓度对大肠杆菌代谢活性的影响。

1.5 生物分子：肽，核酸和抗原核酸

核酸自组装成超分子结构(例如螺旋和环)的能力激发了许多使用水凝胶传感器检测核酸的方法。一种这样的方法依赖于DNA链之间的可逆相互作用来引起凝胶体积的变化。前田证实了使用含有侧链单链(ss)DNA序列的聚丙烯酰胺水凝胶的凝胶溶胀，该DNA序列旨在形成茎环结构(图21A(i))。

图21.使用水凝胶感测核酸的策略。(A)DNA交联的聚丙烯酰胺水凝胶的膨胀(i)和收缩(ii)。(B)由于在聚(丙烯酰胺)聚合物之间发夹DNA分子的聚合而导致的大幅度水凝胶膨胀。(C)凝胶化是检测目标癌症DNA的信号放大手段。

蛋白质类

通过溶胶-凝胶转变检测蛋白质的水凝胶会利用其靶标的酶活性来破坏构成凝胶结构的关键。特别地，具有生物分子作为关键成分的水凝胶，例如肽或DNA水凝胶，可能对蛋白酶或限制性核酸内切酶敏感，它们分别在特定的识别位点切割蛋白质和dsDNA。这实现了将响应性引入水凝胶传感器的便利手段。

在2015年，Liu和Scherman报告了一种均质的双网络水凝胶，该凝胶包含两个互不交联的互穿网络：(1)葫芦[8]尿素(CB [8])和苯丙氨酸官能化的羧甲基纤维素之间的包合物。(2)由DNA Y支架和具有互补“粘性末端”的DNA接头形成的DNA网络(图22A)。(参考：Adv. Mater. 2015, 27, 3298– 3304,)

图22.工程化蛋白质响应水凝胶的策略。(A)通过纤维素酶或核酸酶降解包含CMC-CB和DNA网络的双网络水凝胶。(B)使用生物分子印迹水凝胶对蛋白质进行感测，由于凝胶网络内形成交联，在分析物的存在下其会收缩。

6.微生物

细菌，真菌和病毒感染的威胁推动了许多检测方法的发展，这些检测方法可以通过其代谢产物直接或间接检测它们。

病毒

Spivak建立在上述用于检测蛋白质的“超级适体”水凝胶测定基础上(图22B)，将这项技术扩展到了检测苹果茎点病毒(ASPV)，将这些水凝胶进一步微成型，以形成衍射光栅传感器(图24A)，其衍射距离随着凝胶对ASPV病毒的反应而收缩而减小。(Angew. Chem., Int. Ed. 2014, 53, 2095– 2098,)

细菌

通过靶向某些细菌菌株分泌的特定代谢物或生物分子(例如酶)，可以实现细菌的检测和鉴定。为此，光学方法非常有效，因为可以通过肉眼或简单的手持式紫外线源可视化颜色或荧光的变化。例如，Schnherr开发了一种壳聚糖水凝胶膜，该膜与荧光底物4-甲基伞形基-β-d-葡糖醛酸(MUG)和发色底物4-硝基苯基-β-d-葡糖醛酸(PNPG)共价结合，用于检测大肠杆菌。这些底物可以被98%的已知大肠杆菌菌株分泌的酶β-葡萄糖醛酸苷酶(β-GUS)水解，从而将β-葡萄糖醛酸苷转化为酸和醇(图24B)。(参考：ACS Appl. Mater. Interfaces 2015, 7, 20190– 20199,)

图24.使用“超级适体”水凝胶衍射光栅检测微生物，例如(A)ASPV。(B)通过染料修饰的壳聚糖水凝胶膜通过检测细菌分泌的β-GUS酶对大肠杆菌进行荧光和比色检测的机理。(C)使用生物电致变色测定法感测细菌细胞代谢活力的机制，其中普鲁士蓝(PB)纳米颗粒的形成和深蓝色指示存在的活细菌。